中国海洋大学 生物化学 2013年11月22日作业

作为无经验的新手学生，在生化实验室中，前几周时间花在洗玻璃器皿和黏贴试管标签上。后来过渡到配制各种实验步骤的缓冲液和母液。最后，叫你负责一个蛋白质的纯化，这是柠檬酸循环中的一个酶，位于Mi基质中的柠檬酸合酶。按照一个纯化程序，你根据下列步骤进行。在你工作的时候，一个更有经验的学生问你每一步步骤的基本原理，请提供答案

（1）你从附近的屠宰场买到20kg的牛心脏，在冰上带回，在冰上进行每一个步骤。你用高速匀浆器在含0.2M蔗糖，pH7.2的缓冲液中使牛心组织匀浆

问：你为什么使用牛心组织，且用那么大的量？

将组织保持低温状态和悬浮在0.2M的蔗糖， pH7.2的缓冲液中的目的是什么？

当组织匀浆后发生了什么变化？

（2）你把得到的牛心匀浆用一系列的差速离心，这是什么目的？

（3）你继续用含大多为完整Mi的上清液纯化。接着，你用渗透法裂解Mi，裂解液主要为Mi膜和线粒体内容物组成，对此裂解液，你加入中性盐至特定浓度，然后离心，收集上清液，在上清液中继续加入中性盐，然后离心，保留沉淀，沉淀中含有要分离的蛋白质

问：两步加中性盐的原理是什么？

（4）你把沉淀物重新溶解，用大体积的pH7.2的缓冲液透析过夜。

问：为什么此步骤中透析缓冲液中不加中性盐，

为什么使用缓冲液而不是水？

（5）你将透析后的溶液进行凝胶过滤层析，根据方法，你收集从柱子上下来的第一个组分，弃去其它的组分。你检测各组分蛋白质是通过紫外吸收法。

问：你收集第一个组分这一操作告诉你关于这个蛋白质的什么信息

为什么OD280是检测洗脱组分中蛋白质的存在的方法

（6）你把上一步中收集到的组分进行阳离子交换。当除去开始流出柱子的溶液后，你在柱中加入较高pH值的洗脱液，然后收集流出液，解释你在干什么

（7）你将所得样品进行等电点聚焦电泳，然色后，胶上表现出三条清晰的带。根据经验，感兴趣的蛋白质的PI为5.6，但你决定再测一下蛋白质的纯度，你把PI5.6的带切下，进行SDS-PAGE，此蛋白质表现出单一带。

问：为什么你不能确定等电点聚焦后的单条带是纯品？

SDS的结果告诉你什么？

为什么在等电聚焦后还要跑SDS-PAGE